BFU2016-77363-R. Regulación de autofagia a través de agonistas dopaminérgicos D2R/D3R: Inducción o inhibición, selectividad por D2R o D3R y neuroprotección. (D2RD3Rautophagy)

La disfunción de la autofagia juega un papel fundamental en la patogenia de las enfermedades neurodegenerativas (END) al provocar la formación de agregados de proteínas mal plegadas que en su fase oligomérica son citotóxicos causando la muerte neuronal. Por tanto, la inducción de autofagia, al prevenir la formación de agregados proteicos, es una alternativa terapéutica prometedora en las END. Sin embargo, dependiendo del entorno celular, la autofagia puede causar también muerte celular. Este hecho tiene particular relevancia en las END ya que requieren tratamiento prolongado y los inductores de autofagia disponibles actualmente actúan de forma no-selectiva en todas las células. Sería interesante encontrar inductores de autofagia con un alto índice terapéutico (ratio dosis terapéutica/dosis tóxica) y que actúen de forma selectiva en poblaciones neuronales específicas. Las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas y las medianas espinosas estriatales, dianas principales de la degeneración en la enfermedad de Parkinson (EP) y enfermedad de Huntington (EH) respectivamente, expresan los receptores DAérgicos D2 (D2R) y D3 (D3R). Estudios recientes indican que los ligandos D2R/D3R modulan la autofagia, sin embargo los hallazgos en cuanto a su capacidad inductora o inhibitoria son contradictorios. Tras administración de agonistas o antagonistas D2R/D3R se ha descrito tanto inducción como inhibición/disrupción de autofagia. Las discrepancias pueden deberse a diferencias tanto en las condiciones experimentales como en la interpretación de los marcadores de autofagia. Datos de nuestro laboratorio utilizando pramipexol (PPX), un agonista dopaminérgico D2R/D3R D3R preferente, en modelos celulares y animales muestran que: 1. a bajas dosis, PPX induce autofagia por la ruta clásica (mTOR-dependiente) mediada por D3R, y 2. a dosis más altas, PPX induce cambios en marcadores de autofagia no mediados por D3R. Estos cambios pueden: a) corresponder tanto a activación de autofagia por la ruta mTOR-independiente como a disregulación (inhibición) de autofagia, b) ser mediados por D2R o por mecanismos no DAérgicos, y c) tener un efecto protector o tóxico. Nuestra hipótesis es que el efecto neuroprotector de los agonistas D2R/D3R como inductores de autofagia depende de la selectividad D3R en su señalización. Los agonistas D3R preferentes, administrados a dosis bajas (señalización selectiva D3R), previenen la formación de agregados proteicos por activación de autofagia a través de la vía clásica (mTOR-dependiente). A dosis más altas (no D3R selectivas), actuando bien a través de D2R o de mecanismos no DAérgicos, producen cambios en marcadores de autofagia que pueden estar relacionados con autofagia reactiva a daño celular, disregulación de autofagia y/o activación de apoptosis. El objetivo de este proyecto es:

1. Demostrar que los agonistas DAérgicos D2R/D3R inducen autofagia en neuronas DAérgicas mesencefálicas y medianas espinosas estriatales a través de D3R e inhibición de mTOR,
2. Demostrar que este efecto previene la formación de agregados de a-sinucleína y huntingtina mutada en modelos animales de EP y EH, respectivamente y
3. Investigar si la señalización no-D3R (D2R o no-DAérgicos) de agonistas D2R/D3R provoca autofagia mTOR- independiente, disrupción/inhibición de autofagia y/o daño celular.

Autophagy dysfunction plays a central role in the pathogenesis of neurodegenerative diseases (NDD) by provoking the aggregation of misfolded proteins which are cytotoxic in their oligomeric form and lead to cell death. So, autophagy induction can prevent the formation of protein aggregates and is a promising therapy in NDD. However, depending on the cellular environment, autophagy can also promote cell death. This fact is particularly relevant in NDD because they require long-time treatment and autophagy inducers available nowadays are not selective for specific cell populations. It would be interesting to find autophagy inducers with a high therapeutic index (therapeutic dose/toxic dose ratio) and which act selectively on specific neuronal populations. Midbrain dopaminergic (DAergic) neurons and striatal medium spiny neurons, the main target of degeneration in Parkinsons disease (PD) and Huntingtons disease (HD), respectively, express the DAergic D2 receptor (D2R) and D3 receptor (D3R). Recent reports show that autophagy can be regulated by D2R/D3R ligands. However, the findings about their capacity as inducers or inhibitors are contradictory. Both induction and inhibition/disruption have been described after agonist or antagonist administration. Discrepancies may be due to differences in experimental conditions as well as in the interpretation of autophagy markers. Our experiments using pramipexole (PPX), a D3R preferential D2R/D3R agonist, in cell and animal models show that: 1. At low doses, PPX induces D3R-mediated classical (mTOR-dependent) autophagy, and 2: At high doses, PPX induces non D3R-mediated changes in autophagy markers. These changes may: a) reflect either activation of non-classical autophagy (mTOR-independent) or autophagy dysregulation/inhibition, b) be mediated by D2R or by non-DAergic mechanisms, and c) have a protective or toxic effect. Our hypothesis is that the neuroprotective effect of D2R/D3R agonists as autophagy inducers depends on their selectivity for D3R signaling. At low doses (D3R selective signaling), D3R preferential agonists prevent the formation of protein aggregates through the activation of classical (mTOR-dependent) autophagy. At high doses (D3R non- selective signaling), acting through either D2R or nonDAergic mechanisms, these agonists promote changes in autophagy markers that can be due to autophagy activation in response to cell damage, autophagy dysregulation or apoptosis activation. Our aim is:

1. To demonstrate that DAergic D2R/D3R agonists induce autophagy in midbrain dopaminergic (DAergic) neurons and striatal medium spiny neurons through D3R signaling and mTOR inhibition,
2. To demonstrate that this effect prevents the formation of α- synuclein and mutant huntingtin aggregates in animal models of PD and HD, respectively, and
3. To investigate whether non-D3R (D2R or non-DAergic) signaling of D2R/D3R agonsits promotes mTOR-independent autophagy, autophagy inhibition/disruption and /or cell damage.