El proceso de la neurotransmisión está basado en la capacidad de las vesículas secretoras de almacenar neurotransmisores, y en liberar adecuadamente su contenido en respuesta a estímulos secretores por un proceso universal denominado exocitosis. Es pues el funcionamiento de la vesícula secretora la clave para el buen funcionamiento de las respuestas fisiológicas y, puede probablemente estar tras la génesis de enfermedades neurológicas y psiquiátricas. Este proyecto, está planteado para 3 años y es continuación de nuestra línea de investigación de los últimos 25 años. Nos planteamos tres preguntas derivadas de la naturaleza de las vesículas secretoras y hemos diseñado los abordajes experimentales para contestarlas:
Para contestar a las dos primeras preguntas utilizaremos técnicas bien implementadas en nuestro laboratorio: cultivos celulares de cromafines y de feocromocitoma PC12, fraccionamiento subcelular, purificación de vesículas secretoras (o gránulos cromafines), DLS (Dynamic Light Scattering), citometría de flujo, amperometría, electroquímica intracelular, HPLC, microscopía de onda evanescente (TIRFM) y confocal. También la elaboración de sondas fluorescente mediante técnicas de biología molecular y de proteínas. Para contestar a la tercera pregunta estudiaremos la capacidad funcional de plaquetas y mastocitos humanos (de voluntarios y de enfermos de Parkinson) para acumular y liberar serotonina ya que estas células utilizan mecanismos similares (si no idénticos) a los de las neuronas dopaminérgicas. Nuestras hipótesis de trabajo son que la heterogeneidad de las vesículas secretoras se debe a una heterogeneidad funcional, que el gran compartimento de vesículas no liberables funciona como un reservorio móvil de catecolaminas para el relleno de los gránulos competentes. También que la muerte selectiva de neuronas dopaminérgicas se debe a la acumulación citosólica de dopamina y de DOPAC por el mal funcionamiento de los sistemas de acumulación vesicular y que este fallo será común (aunque sin esas consecuencias letales) a otras células secretoras periféricas que sí podemos estudiar directamente.
The process of neurotransmission is based on the ability of the secretory vesicles to store neurotransmitters and on the ability to adequately release their content, in response to secretory stimuli, by a universal process called exocytosis. It is therefore the function of the secretory vesicle the key of the physiological responses and, probably, be behind the genesis of neurological and psychiatric diseases. This project is planned for 3 years and is a continuation of our line of research for the last 25 years. We posed three questions derived from the nature of the secretory vesicles and we have designed the experimental approaches to answer them:
To answer the first two questions, we will use well-implemented techniques in our laboratory: cell cultures of chromaffin cells and pheochromocytoma PC12, subcellular fractionation, secretory vesicle purification (or chromaffin granules), DLS (Dynamic Light Scattering), flow cytometry, amperometry, Intracellular electrochemistry, HPLC, evanescent wave (TIRFM) and confocal microscopy. Also, we will develop fluorescent probes using techniques of molecular biology and proteins. To answer the third question we will study the functional capacity of human platelets and mast cells (from volunteers and Parkinson’s patients) to accumulate and release serotonin as these cells use similar (if not identical) mechanisms to those of dopaminergic neurons. Our working hypotheses is that the heterogeneity of the secretory vesicles is due to functional heterogeneity, that the large compartment of non-releasable vesicles functions as a mobile reservoir of catecholamines for the filling of the competent granules. Also that the selective death of dopaminergic neurons is due to the cytosolic accumulation of dopamine and DOPAC due to the malfunctioning of vesicular accumulation systems and that this failure will be common (although without those lethal consequences) to other secretory cells that we can be directly studied.